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科普丨间充质干细胞生产流程中微生物污染风险的控制


2019-01-25 10:34:04      来源:


      随着科学技术的发展,以往许多难以治疗的疾病目前都得到了很好的控制甚至能够治愈,这得益于许多新药物及新的治疗方法的开发。

      在众多的新型治疗方法中,细胞治疗尤其是干细胞治疗技术近年来成为医学领域研究的热点,与此同时干细胞治疗作为新型的药物不断进入临床研究领域。

      美国、欧盟、中国等国已批准多项干细胞治疗项目进入临床实验阶段。其中间充质干细胞因其来源不受伦理学约束和多向的分化能力,成为人们研究的热点。

      间充质干细胞具有分化为脂肪、骨、肌肉、等多种组织细胞的多项分化潜能,因此具有极高的研究价值和广阔的临床应用前景。有别于传统的治疗药物,间充质干细胞作为治疗药物时直接将活细胞注入患者体内,其是“有生命力”的。同时也因为其是具有生命力的活细胞药物,其生产和质量控制方法与传统药显著不同。

      传统药物生产科通过分离纯化,灭菌等操作使得药物达到质量标准。而细胞类药物显然不能通过上述方法途径来实现,只有通过生产过程严格及苛刻的质量控制方法来实现。

      间充质干细胞属于干细胞类产品,适用于作为药品进行质量管理,需要建立相应的质量管理体系(QCP),该体系应该覆盖整个体外培养过程,及从细胞的采集和分类开始,包括试剂及原材料控制、中间体(次代培养物)以及最终成品细胞株都应该进行质量管理。

      间充质细胞的体外培养是研究和生产的基础,间充质干细胞的体外培养面临的最严峻的挑战是外源性污染,特别是外源性微生物的污染,对间充质干细胞生产过程质量控制很大程度上也就是控制外源性的微生物污染[1]。

      这些外源性的微生物可能来源于种子细胞、培养材料、培养试剂及环境因素,主要包括细菌,真菌,酵母,支原体,病毒和内毒素。如果将有上述污染的细胞注入患者体内,将会引起发热、寒战、感染、不可逆转的脓毒血症、甚至是死亡[2]。

      如前所述间充质细胞属于有生命力的药物,无法使用化学灭菌或物理灭菌的方法,因此在QCP建立之前我们需要充分分析微生物污染的风险性,并通过学科的方法手段进行检测,以保证产品质量。

      我们通过文献调研,对于间充质干细胞的微生物污染控制方法进行归纳分析,主要对微生物质量控制方法中的供体微生物筛查、常见细菌真菌污染、支原体检测、内毒素检测、病毒检测等微生物控制等等方面的内容进行探讨。

间充质干细胞的微生物污染风险控制

      药物是通过一系列生产操作获得的终端产品,其最终是应用于人体,因此必须保证药物质量。间充质干细胞作为药物应用与临床同样必要保证其质量,同时间充质干细胞作为特殊的以活细胞为主的生物治疗药物,其质量标准应该更加严格。

      微生物污染是间充质细胞生产过程中最主要的问题。生产制备过程中微生物污染会影响细胞的质量和严重威胁患者的安全性。

       目前尚无完善的微生物污染控制标准等相关参考文件,为保证产品质量,微生物污染控制只要通过如下四方面来保证[2]:

(1)保证供体细胞无污染,包括无微生物污染,未携带支原体和病毒等外源性微生物;
(2)保证生产过程所用各种培养基的“纯净”,保证所使用器具无菌,保证生产工艺过程中不会携带外源性微生物进入培养体系;
(3)对试验、生产,存储环境条件进行严格控制,并定期排查,保证环境要求达到生产需求;
(4)建立健全细胞生产微生物污染检测方法体系,保证产品质量。

      在间充质细胞生产中,GMP 标准已成为其生产的最低质量控制标准,我们应该在 GMP 的基础上严格按上述四条基本指导原则来生产,并积极探索有效减低间充质细胞生产过程中微生物污染风险的有效途径。

间充质干细胞的常见生产流程

      间充质干细胞作为一类人体细胞,其在培养与生产流程上于其他种类细胞有一定的共同之处,但其作为一种特殊的干细胞在生产过程中也有其特殊性。目前尚无间充质干细胞生产的 ISO,其基本流程为:首先从供体中获取原代细胞,然后原代细胞经传代获得稳定的生产用细胞,生产用种细胞经过大规模扩增并纯化分装得到最终产品。




间充质干细胞常见生产流程,图片源自:参考资料[2]

供体的微生物污染的防控
移植风险人群的界定

      细胞的移植必须保证移植细胞的质量、有效性和安全性。细胞的安全性决定于细胞的来源、生产、检验和存储的步骤。

首先细胞的来源及性质对后续的生产起到决定性作用。而供体自身状态决定细胞的性质。因此,必须选择健康正常的细胞及组织作为供体细胞的来源,细胞供体不能携带任何外源性微生物如病毒支原体等。

供体的感染性疾病筛查

      所有的人细胞都有潜在的传播感染性疾病的可能。在细胞移植治疗中,过去对供体的细胞可能携带病毒筛查主要为:人获得性免疫缺陷病毒(HIV),B 型肝炎病毒(HBV),C 型肝炎病毒(HCV)[2-7]。

      病毒的检测只要通过相应抗体的免疫应答反应来检测,但研究显示,在上述病毒的潜伏期内,机体并不产生相应抗体,特别是 HIV 和 HCV 病毒在其潜伏期内用抗体免疫应答方法是无法检测出的。

      因此处于潜伏期内的上述病毒的检测需采用 PCR 法对病毒基因片段进行特异性扩增来检测。虽然 HIV、HBV、HCV 及人 T 细胞淋巴管状病毒(HTLV)感染人群数量不多,但是为了保证患者的安全,必须要对供体细胞进行上述病毒的筛查,常用的筛查方法即为核算检查法(NAT)。根据世界卫生组织 2000 年的规定,必须对供体细胞进行表1中病原微生物的检测。



世卫组织规定的供体细胞微生物检查

      供体细胞是间充质干细胞的来源,必须保证来源的间充质细胞不携带任何的微生物才能用其进行后续的研究生产。如果原代细胞已携带微生物,则所有的研究及生产都是无意义的,甚至会危及患者生命安全。因此供体细胞的微生物筛查是培养前的必须步奏。

生产流程中的微生物防控

      细胞的体外培养是在相对暴露的环境中进行的,细胞直接与培养动物来源的培养基组分、容器和环境中的空气接触。

在保证原代细胞的质量后,培养中所用培养基组分、实验室条件中微生物的种类和数量将对细胞培养的顺序进行起到至决定性作用。

在细胞培养过程中常见的微生物污染主要有:细菌、真菌、酵母、支原体、内毒素、病毒及未知微生物和其它细胞的污染

细菌、真菌污染筛查

      在细胞培养过程中,细菌和真菌为最常见的污染源。常见的污染细菌有大肠杆菌、假单胞菌、葡萄球菌等[9]。细胞培养被细菌污染后通产培养基的pH会发生改变而导致出现肉眼可见的显著变化,如浊度变化、颜色变化等。

      被细菌污染的细胞在初期还能够存活,但若不进行及时处理,随后细胞会快速死亡。发现细胞培养过程中发现细菌污染后应及时处理,以免污染其它培养基。常用处理方法为灭菌丢弃或添加抗生素。

      细菌污染常导致生产失败,使原料浪费,增加成本,在生产过程中应注意防控。细菌污染常是由生产环境中引入的,因此必须对环境中的微生物进行处理和监控以保证环境的洁净度。
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